Nature Chemistry：揭示多功能周环蛋白酶LepI的催化分子机制

在溶剂之中，早先负离子能够同时借助于多个氢-氢/氢-秽氢原子键，并且不一定不具备更佳的地带依赖性和立体依赖性。但在自然界之中，乙烯早先负离子的细胞内酶却只有少数被报道过。分支乙酸有规律细胞内酶（chorismate mutase）、precorrin-8x甲基有规律细胞内酶、SpnF和PyrI4等早先细胞内酶的结构上表明自然生命体造出了多种可以乙烯[4+2]一个环加成负离子及其他早先负离子的细胞内前端双键，并且这些结构上可以调控早先负离子的地带依赖性和立体依赖性。2017年，UCLA的宋初奕讲师课题组报道了一种S-腺苷甲硫氨乙酸（SAM）依赖的多基本功能早先细胞内酶LepI，它既能乙烯秽Diels-Alder（HDA）负离子，又能乙烯反为Claisen芳基负离子6。在没有人LepI存在下，衍生物2可以自发沉淀物构成(E)-3和(Z)-4，并大幅度自发再次发生分子结构内Diels-Alder负离子（IMDA）或HDA负离子生成一系列的一个环加成负离子游离。而在LepI的乙烯下，2只能选择性地沉淀物构成(E)-3，并大幅度再次发生HDA负离子构成单一游离10，即Leporin C。LepI仅指O-甲基转移细胞内酶后裔，但是它没有人甲基转移细胞内酶活性。为什么该细胞内酶可以立体依赖性地乙烯沉淀物负离子、HDA负离子和反为Claisen芳基负离子？SAM的作用又是什么？为了回答这些问题，2019年7同年21日，之国家科委南京有机工程学原始数据分析所的周佳海课题组和UCLA的宋初奕课题组合作在Nature Chemistry秽志上刊发Structural Basis for Stereoselective Dehydration and Hydrogen-Bonding Catalysis by the SAM-Dependent Pericyclase LepI，判别了可视的LepI及其与衍生物1、8、10的复合物石墨结构上，并通过与UCLA的Kendall Houk课题组合作组织起来理论算出实习，行之有效阐释了LepI乙烯的分子结构前提。在这些复合物结构上之中，衍生物1是作为沉淀物负离子的负离子乙酰来与LepI展开铪测试，目的是阐释立体依赖性沉淀物负离子特异性；衍生物10是HDA负离子和反为Claisen芳基负离子的游离，其与LepI的复合物石墨结构上可以用来相比较负离子前后的双键究竟产生改变；exo游离8作为endo游离9的乙酰，其与LepI的复合物结构上可运用于阐释反为Claisen芳基负离子的特异性。LepI细胞内的母体结构上通过硒氢原子的单散射反常散射方法被判别。在该结构上之中，两分子结构的LepI以N后端结构上域相缠绕交错在一起，而C后端结构上域则是不具备O-甲基转移细胞内酶后裔十分相似的Rossman前端这种超二级结构上，且每分子结构的LepI混合理应辅细胞内酶SAM。凋亡体细胞内酶活测定测试推测了H133、R295和D296对乙烯活性的决定性作用，混合LepI-SAM-1、LepI-SAM-8、LepI-SAM-10复合物结构上以及对立体工程学复合物结构上的算出，该文设想LepI的乙烯前提很有可能如下：1. 沉淀物特异性有可能为E1-cb途径：决定性负离子H133作为盐酸，去负离子苯上的4-OH，并且平衡附加的烯醇，而侧链上的吡啶以官能团共平面的方向回去，R295以及周围的工程学键因特网对此有依赖性。进入的阴离子(W')有可能暂时被这些残留物困住，并与氢乙酰保持工程学键。LepI的沉淀物作用是通过将乙酸和盐酸配置在官能团顺式和将非对称的醇负离子2固定在附加的官能团双键之中来实现1，4-官能团消除的。2. 在HDA负离子之中，由于苯一个环上有过多的空间，所以侧链肟可自发旋转轴到适宜负离子再次发生的一段距离。小刀周围的磁性作用和亲水作用都是对映依赖性实现的决定性。更极为重要的是，H133和R295可以作为工程学键给体，起到了平衡立体工程学的作用，减少了反映能垒。3. 在之前的报道之中，SAM之中的空穴对细胞内酶活十分极为重要，这显然了SAM有可能不具备电弧乙烯的作用。电弧乙烯是最近被挖掘出的一种乙烯模式。LepI的活性小刀是磁性的，磁性较低，少数的磁性负离子可产生一个合适的电场，使负离子物正处于适宜负离子再次发生的取向，平衡立体工程学，减少能垒，倡导负离子的再次发生。虽然石墨结构上之中SAM与负离子并没有人直接接触，但是SAM上的空穴亦会影响活性小刀的电场，可以可推测SAM可以平衡比负离子物不具备更佳偶极矩的立体工程学。4. 对于反为Claisen芳基负离子，衍生物9已经正处于吻合NAC（near-attack conformation）的双键。将H133凋亡为Q或N，该负离子活性大大的下降，这明确指造出H133极有可能亦会是负离子的。混合算出，可推测LepI通过H133和R295的负离子和电弧作用，激活了反为Claisen芳基的负离子，平衡了立体工程学，从而乙烯了该负离子。LepI-SAM-1、LepI-SAM-8和LepI-SAM-10复合物石墨结构上之中的活性小刀。LepI-SAM-1复合物结构上之中，苯上的吡啶与H133有工程学键作用，六元一个环上的甲烷氢原子和侧链上的羰基与R295、D296等负离子及小刀之中的阴离子构成了一个工程学键因特网。值得注意的是，结构上之中的肟侧链并没有人往一个环方向西南方，构成易于再次发生DA负离子的双键，而是溶剂之中的夺取了一个环上方的一段距离。对比三个复合物石墨结构上可以看造出，二者苯及苯一个环的混合一段距离相异，工程学键因特网也基本相同多种不同，但R295的双键再次发生了较大的变化。在O-甲基转移细胞内酶类后裔之中，存在着His-Glu乙烯二联体。而在LepI之中，His-Glu之中的His被Arg（R295）摒弃了。相相比较His，Arg是更多的工程学键给体，电弧平衡作用也更佳；且Arg盐酸性更弱，更容易停留在负离子的状态。这很有可能就是LepI能乙烯早先负离子而不是甲基转移负离子的决定性。该实习不仅开拓了我们对O-甲基转移细胞内酶类后裔的基本功能层面，也让我们对SAM的作用有了新的认识，同时也伴随着SAM及依赖SAM的细胞内酶在生物肠道之中还有更多新的作用和基本功能等着科学家去挖掘出和探索。相相比较溶剂之中的乙烯剂，乙酰之中的细胞内酶不一定不具备更佳的立体选择性和乙烯效率。鉴于早先负离子在合成应用领域之中的极为更为重要，对新型早先细胞内酶的挖掘出和探索在未来乙酰以及溶剂方法之中校都有著巨大的潜质。周佳海课题组的博士生蔡毓娟、宋初奕课题组的研究生Yang Hai和Masao Ohashi并列期刊第一作者。石墨衍射原始数据分别在南京光源BL17U1、BL18U1和BL19U1线站收集的。专家都对戈惠明（南京大学生命科学学院讲师，国家优秀青年Fund得主）早先负离子是一类在负离子更进一步之中可构成一个环状立体工程学的负离子，在溶剂之中不具备极为重要的应用。在微生物之中，最近也挖掘出了一系列早先负离子细胞内酶，如Claisen芳基负离子细胞内酶，Cope芳基负离子细胞内酶以及Diels-Alder负离子的细胞内酶等，其之中以Diels-Alder负离子细胞内酶被挖掘出的相当多，原始数据分析相对仔细分析。在2017年，UCLA的宋初奕课题组在对来源于曲霉菌的Leporin C展开乙酰原始数据分析时挖掘出，LepI尽管被注释为一个SAM依赖的甲基转移细胞内酶，然而却挖掘出可以同时乙烯沉淀物负离子、Diels-Alder、秽Diels-Alder以及反为Claisen芳基等负离子，是一罕有的多基本功能早先负离子细胞内酶。那么，基本功能如此多种不同的LepI是如何体现乙烯作用的，SAM在乙烯更进一步之中体现了什么作用，活性之间是如何各派系各步负离子的间的关系的？这些问题均有待解答。近日，之国家科委南京有机工程学原始数据分析所的周佳海课题组和UCLA的宋初奕课题组合作说明了了LepI乙烯的分子结构前提。他们通过判别沉淀物负离子的负离子乙酰衍生物1与LepI的铪结构上，阐释了LepI立体依赖性沉淀物的负离子特异性。同时，挖掘出LepI在乙烯HDA的负离子之中，由于苯上的侧链肟自发旋转轴到有适宜负离子再次发生的一段距离，H133和R295通过构成工程学键平衡了立体工程学，减少了负离子能垒使得负离子得以展开。通过对LepI-SAM-1的复合物石墨结构上展开判别，挖掘出SAM在负离子之中并没有人与负离子再次发生直接的作用而是构成一个工程学键因特网，通过电弧乙烯来无论如何。通过判别衍生物8与LepI的铪结构上同时混合工程学算出，确定LepI通过H133和R295的负离子和电弧作用，激活了反为Claisen芳基的负离子，平衡了立体工程学，从而乙烯了该负离子。通过对决定性乙烯活性的点凋亡，推测可推测的前提是合理的。之后作者通过将LepI与O-甲基转移细胞内酶类后裔之中的其它细胞内酶展开相比较挖掘出，原来的乙烯二联体His-Glu在LepI之中生命体成为Arg-Glu，这一变化使得LepI生命体为一个多基本功能的早先负离子细胞内酶。早先负离子细胞内酶由于高度的立体选择性和高效的电子对模式在天然游离乙酰之中有极为重要的作用。而LepI作为现有被报道的非常罕有的多基本功能早先负离子细胞内酶，对其乙烯前提的明了阐述为今后大幅度改造和利用造就了基础。原始造出处：Yujuan Cai, Yang Hai, Masao Ohashi, Cooper S. Jamieson,et al.Structural basis for stereoselective dehydration and hydrogen-bonding catalysis by the SAM-dependent pericyclase LepI ,Nature Chemistry (2019) ,Published: 22 July 2019